Генная модификация и терапия

Генная терапия представляет собой введение генов в клетки человека для лечения болезней, например,наследственных заболеваний.

Основная проблема генной терапии — разработка эффективного и безопасного способа переноса необходимых генов в дефектные клетки организма. В качестве «средств доставки» генов используют различные векторы, наиболее часто — различные вирусы (см. ниже). В настоящее время разработки генной терапии касаются только соматических клеток.

14 сентября 1990 г. была проведена первая успешная попытка коррекции генных дефектов при наследуемом Т- клеточном иммунодефиците, связанном с недостаточностью фермента аде-нозин дезаминазы. Двум больным девочкам провели пересадку собственных Т-лимфоцитов, в которые был внесён трансген — нормальный ген недостающего фермента. В результате нескольких проведённых инфузий у обеих пациенток наступило полное выздоровление. В настоящее время несколько тысяч больных несут в своём организме клетки, генетически изменённые искусственным путём.

В 1992 г. в США осуществили введение в клетки печени человека гена белка-рецептора, адсорбирующего липопротеины низкой плотности в гепатоциты женщины, страдающей выраженным атеросклерозом (патология была связана с дефицитом липопротеинов вследствие генных нарушений). Посредством трансфекции ген был введён в гомогенизированные клетки печени, которые затем переносили в печень пациентки. После такой процедуры состояние женщины улучшилось, хотя до пересадки «генно-инженерной печени» она перенесла
инфаркт (в 16 лет) и операцию на сердце (в 26 лет).

Подходы генной терапии

Ученые впервые предприняли логические шаги в попытке ввести гены непосредственно в клетки человека,сосредоточив внимание на заболеваниях, вызванных дефектом одного гена, таких как муковисцидоз, гемофилия, мышечная дистрофия и серповидно-клеточная анемия. Тем не менее, это оказалось труднее, чем изменить генотип бактерий, в первую очередь из-за проблем, связанных с большими участками ДНК и доставки векторов на правильный локус сравнительно больших геномов. В настоящее время большинство исследований генной терапии, направленных на лечение рака и наследственных заболеваний, связанных с генетическими дефектами.

Виды генной терапии

Генная терапия может быть классифицирована на следующие типы:

• Генная терапия зародышевой линии

В случае генной терапии зародышевой линии, половые клетки (сперматозоиды или яйцеклетки) изменяют путем введения функциональных генов. Таким образом, изменения после данного вида генной терапии являются наследственными и будут передаваться последующим поколениям. Этот новый подход, теоретически, должен быть весьма эффективным в профилактике генетических заболеваний.

• Соматическая генная терапия

В случае соматической генной терапии терапевтические гены вводятся в соматические клетки пациента. Любые изменения будут ограничены отдельным пациеном и не будут унаследованы потомством пациента или последующими поколениями.

Существуют различные методы замены и репарации генов, используемых в генной терапии:

§ Нормальный ген может быть помещен в неспецифическое местоположение в геноме, чтобы заменить нефункциональный ген. Этот подход является наиболее распространенным.

§ Аномальные гены могут быть заменены на нормальные гены путем гомологичной рекомбинации.

§ Аномальные гены могут быть исправлены с помощью селективной обратной мутации, которая возвращает ген в нормальное функциональное состояние.

§ Регуляция (степень, при которой ген включен или выключен) конкретного гена может быть изменена.

Векторы в генной терапии

В настоящее время разработаны три основных вида генной терапии, различаемых по способу доставки вектора в поражённые клетки.

Генная терапия ex vivo. Поражённые клетки выделяют из организма пациента, инкубируют с вектором, после чего генно-инженерные (генетически изменённые) клетки вносят в организм. Наиболее часто метод применяют в отношении клеток крови. Это связано с простотой их выделения и последующего обратного введения.

Генная терапия in situ. В этом случае вектор вводят непосредственно в поражённые ткани. Например, пациентам с муковисцидозом аденовирусные векторы доставляют непосредственно в трахею и бронхи; в некоторые опухоли непосредственно инъецируют вектор, несущий цитокин или токсин; в мышцу больного, страдающего мышечной дистрофией, производят инъекцию вектора, несущего ген дистрофина.

Генная терапия in vivo — вектор вводят в кровоток. До настоящего времени на практике этот метод не применяли, однако метод прост и удобен, поэтому его считают наиболее перспективным.

Вирусы

Все вирусы связываются с клетками хозяев и вводят свой генетический материал в эти клетки, что является частью их цикла репликации. Этот генетический материал содержит основные «указания» о том, как производить больше копий этого вируса. Клетки-хозяина будут выполнять эти «указания» и производить дополнительные копии вируса, что приводит к все более и более активному заражению новых клеток.

Врачи и молекулярные биологи осознали, что вирусы могут быть использованы в качестве средства для внесения «хороших» генов в клетки человека. Вначале ученые удалили бы гены вируса, которые вызывают болезнь. Затем они заменили бы эти гены на гены, кодирующие желаемый эффект (например, производство инсулина в случае диабетиков). Эта процедура должна быть выполнена таким образом, чтобы гены, которые позволяют вирусу встраивать его геном в геном другого организма, оставались нетронутыми. Это может приводить к путанице, что требует значительных исследований и понимания генов вируса для того, чтобы знать функции каждого из них.

Ретровирусы

Генетический материал ретровирусов представлен молекулами РНК, в то время как генетический материал их хозяев - молекулами ДНК. Когда ретровирус заражает клетку-хозяина, он внедряет в клетку свою РНК вместе с некоторыми ферментами, такими как обратная транскриптаза и интеграза. Процесс получения копий ДНК из молекулы РНК называется обратной транскрипцией. Он осуществляется с помощью фермента вируса, который называется обратная транскриптаза. После этого создаются копии ДНК, которые встраиваются в геном клеток хозяина с помощью фермента интегразы.

Теперь, когда генетический материал вируса был внедрен, можно сказать, что клетка хозяина была изменена и содержит новые гены. Если эти клетки хозяина впоследствии делятся, его потомки будут содержать новые гены.

Генная терапия с использованием ретровирусных векторов для лечения Х-связанных тяжелых комбинированных иммунодефицитов представляет собой наиболее успешное применение генной терапии на сегодняшний день.

Более двадцати пациентов прошли лечение во Франции и Англии, при этом наблюдается высокая скорость восстановления иммунной системы.

Аденовирусы

Аденовирусы- вирусы, которые несут свой генетический материал в форме двухцепочечной ДНК. Они вызывают респираторные, кишечные и глазные инфекции у человека. Когда эти вирусы заражают клетки-хозяина, они вводят свою молекулу ДНК в клетки хозяина. Генетический материал аденовирусов не включается в генетический материал клеток хозяина. Молекулы ДНК остаются свободными в ядре клеток хозяина. Этот вектор был исследован для лечения рака и являлся первым лицензированным продуктом генной терапии для лечения рака.

Недостатки использования вирусов:

§ инициация иммунного ответа на введение инородного белка

§ реактогенность самих вирусных препаратов

§ часто – отсутствие тканевой специфичности

§ трудности и дороговизна массового производства

§ риск опухолеродных мутаций вируса или рекомбинации активных патогенных частиц

Невирусные методы

Метод «голой» ДНК

Это самый простой метод невирусной трансфекции. Клинические испытания, проведенные путем выполнения внутримышечной инъекции «голой» ДНК-плазмиды, имели некоторый успех, однако, выраженность эффекта была очень низкой по сравнению с другими методами трансфекции. В дополнение к испытаниям с плазмидами проводились исследования с «голыми» ПЦР-продуктами, которые имели аналогичный или немного больший успех.

Обнажённая ДНК при внутримышечном введении способна экспрессироваться в количествах, достаточных для развития иммунного ответа на появление новых белков. Этот эффект потенциально может быть использован в целях вакцинации против определённых патогенных вирусов, однако не достаточен для большинства терапевтических целей.

Для доставки генетического материала идеальной представляется "молекулярная машина", обладающая такими качествами как:

1. высокая степень безопасности и надёжности в сочетании с достаточной дешевизной и возможностью широкого применения;

2. способность сохранять активность при движении в русле крови в течение длительного и контролируемого времени, и при этом не распознаваться иммунной системой, не вызывать воспалительных процессов;

3. высокая избирательность взаимодействия только с клетками-мишенями;

4. достаточный объём генетической информации и высокая эффективность, при которой достигается экспрессия каждой доставляемой молекулы ДНК;

5. возможность трансформировать заданное количество клеток от нескольких процентов до заведомо гарантированной 100%-й трансформации, что особенно важно при лечении онкологических заболеваний и некоторых вирусных инфекций;

6. возможность контролировать как интенсивность, так и время экспрессии на основе данных клинического наблюдения.

Липоплексы и полиплексы

Для улучшения доставки новой ДНК в клетку эти молекулы должны быть защищены от повреждений, а также их поступление в клетку должно быть облегчено. С этой целью были созданы новые молекулы – липоплексы и полиплексы, которые имеют способность защищать ДНК от нежелательной деградации во время процесса трансфекции.

Плазмидная ДНК может быть покрыта липидами, образуя организованную структуру, такую как мицелла или липосома. Когда эта организованная структура находится в комплексе с ДНК, ее называют липоплекс. Есть три типа липидов: анионные (отрицательно заряженные), нейтральные и катионные (положительно заряженные).
Первоначально для строительства липоплексов использовались анионные и нейтральные липиды. Тем не менее, несмотря на факты об их малой токсичности, совместимости с жидкостями организма и их адаптивности к конкретным тканям, они являются сложными и трудоемкими для производства, поэтому внимание было обращено на катионные липиды.

Наиболее распространено использование липоплексов для переноса генов в раковые клетки, в результате чего активируются гены-супрессоры опухолевых клеток и уменьшается активность онкогенов. Недавние исследования показали, что липоплексы могут быть успешно использованы в трансфекции клеток респираторного эпителия, поэтому они могут быть использованы для лечения генетических заболеваний дыхательных путей, таких как кистозный фиброз.

Гибридные методы

Т.к. у каждого метода переноса генов имеются недостатки, были разработаны некоторые гибридные методы, объединяющие два или несколько методов. Виросомы являются одним из примеров - они сочетают в себе липосомы с инактивированным ВИЧ или вирусом гриппа. Было показано, что с помощью виросом перенос генов в клетки респираторного эпителия является более эффективным, чем с помощью любого вирусного или липосомального метода. Другие методы предусматривают объединение других вирусных векторов с катионными липидами или гибридизацию вирусов.

Генотерапия различных заболеваний

1. Моногенные наследственные заболевания.

Наследственные заболевания, генетическая коррекция которых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспериментальных разработок (ЭК) и принципиально возможна (ПВ).

Стадия клинических испытаний: иммунодефицит, гемофилия В, болезнь Гоше, муковисцидоз.

Стадия экспериментальных разработок: гемофилия А, эмфизема лёгких, фенилкетонурия, мышечная дистрофия Дюшенна, талассемия, серповидноклеточная анемия, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хронический грануломатоз, респираторный дистресс-синдром.

ПРИМЕР: Некоторые нарушения работы головного мозга (в частности, болезни Паркинсона и Альцгеймера) связаны с повреждением клеток, вырабатывающих нейромедиаторы. В результате мозг не может нормально регулировать двигательную деятельность человека.

Такие болезни лечат препаратами медиаторной природы, однако, со временем организм утрачивает чувствительность к ним. Кроме того, они могут оказывать неблагоприятное побочное действие.

В последнее время пытались лечить паркинсонизм пересадкой тканей, способных продуцировать
нейромедиаторы. Трансплантатом может быть ткань мозга человеческих эмбрионов или мозгового слоя надпочечников самого больного. Но при использовании чужеродных тканей возникают проблемы тканевой несовместимости, а также юридические и этические. Помимо этого такие операции далеко не всегда приводят к хорошим результатам.

Ф. Гейдж с соавторами (Калифорнийский университет, Сан-Диего, США) в экспериментах на крысах использовал генную инженерию для борьбы с болезнями нервной системы. У животных забирали клетки кожи и вводили в них вирус, содержащий ген, кодирующий фермент тирозингидроксилазу. Фермент катализирует превращение аминокислоты тирозина в нейромедиатор L-ДОФА. Клетки со встроенным геном имплантировали в мозг крыс с предварительно разрушенным участком мозга, у которых наблюдались нарушения работы ЦНС, подобные болезни Паркинсона у человека. После пересадки модифицированных клеток у 40% животных состояние улучшилось. Авторы считают, что использование для пересадки собственных клеток реципиента перспективно для лечения больных паркинсонизмом.

Стадия принципиально возможной генокоррекции: Болезнь Хантера, синдром Гурлера, гипераммонемия, цитрулинемия, метахроматическая лекодистрофия, синдром Леш-Нихана.

2. Ненаследственные заболевания.

Одновременно с развитием исследований в области генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались поиски методов терапевтического использования смысловых последовательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний, и главным образом злокачественных опухолей и вирусных инфекций.

ПРИМЕР: Лекарственные препараты для лечения герпеса малоэффективны. Одна из причин-недостаточная их способность проникать внутрь клеток, где находится вирус-возбудитель данного заболевания.

Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний:

§ повышение иммунореактивности опухоли;

§ генетическая модификация иммунных клеток;

§ инсерция генов "чувствительности" либо "генов-самоубийц";

§ блок экспрессии онкогенов;

§ инсерция генов-супрессоров опухолей;

§ защита нормальных клеток от химиотерапии;

§ индукция синтеза противоопухулевых вещнств нормальными клетками;

§ продукция противоопухолевых рекомбинантных вакцин;

§ локальная радиопротекция нормальных тканей с помощью антиоксидантов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Culver K.W. Gene Therapy: A Handbook for Physicians. N.Y.: May Ann Liebert Inc. Publ., 1994. 117 p.

2. Kay M.A., Liu D., Hoogerbrugge P.M. // Gene Therapy: Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 12744-12746.

3. Cohen-Haguenauer O. Gene Therapy: Regulatory Issues and International Approaches to Regulation // Curr. Option in Biotechnol. 1997. Vol. 8. P. 361-369.

4.Hodgson C.P. The Vector Void in Gene Therapy // BioTechnology. 1995. Vol. 13. P. 222-225.

5.Smith K.T., Shepherd A.J., Boyd J.E., Lees J.M. Gene Delivery Systems for Use in Gene Therapy: An Overview of Quality Assurance and Safety Issues // Gene Therapy. 1996. Vol. 3. P. 190-200.

6.Moreadith R.W., Radford N.B. Gene Targeting in Embryonic Stem Cells: The New Physiology and Metabolism // J. Mol. Med. 1997. Vol. 75. P. 208-216.

7.Herrman E. Clinical Application of Gene Transfer // Ibid. 1996. Vol. 74. P. 213-221